对于CAR-T细胞治疗，CAR分子是影响治疗有效性的关键。CAR分子结构包含识别肿瘤抗原的抗体单链可变区、铰链区，以及胞内的共刺激结构域、信号传导域，其设计的合理性会影响CAR-T细胞的杀伤效应、体内持久性、以及安全性等。因此，针对不同的肿瘤治疗靶点，我们需要设计合理有效的CAR分子，并包装成CAR慢病毒，用于后续CAR-T细胞的构建。

将表达CD19抗原的慢病毒纯化液进行梯度稀释（0.01、0.1、1、10 μl），分别加入到相同数量的293T细胞中，72小时后流式检测293T细胞阳性率，进而按如下公式计算慢病毒的转导滴度：

如图所示，CD19抗原阳性细胞的数量随转染病毒梯度的增加而逐渐升高，表明该慢病毒有良好的感染活性，并按上述公式计算病毒滴度为：1.4×10⁸ Tu/ml。

我们将成功制备的上述CD19病毒转染293T细胞，经过多轮筛选获得阳性率几乎为100%的CD19-293T细胞，其阳性率检测结果如下图所示。

我们将针对CD19靶点设计的二代经典CAR分子构建到慢病毒载体中，并包装得到CD19-CAR慢病毒，采用上述方法检测病毒滴度，经计算后得到病毒滴度为：4.33×10⁸ Tu/ml。

在完成CAR病毒的包装后，下一步需对T细胞进行细胞转染，从而获得CAR-T细胞。我们建立了两种不同的高效的T细胞制备方法，均能制备高纯度的T细胞（CD3+细胞占比可达98%以上），但二者扩增出来的不同亚型T细胞的占比有较大的差异，Method 1扩增出来的T细胞以CD8+T细胞亚型为主，而Method 2可扩增出CD8+T细胞和CD4+T细胞占比差异较小的T细胞群体，这两种方法为研究不同亚型T细胞的作用奠定了坚实的基础。

慢病毒是目前构建CAR-T细胞的重要基因递送工具，不同的T细胞活化扩增方法、不同的转染时间等多方面因素都会影响CAR-T细胞的阳性率。我们通过多方面的实验条件优化，成功建立了高效的基于慢病毒转染的CAR-T细胞制备工艺。下图展示的是CD19 CAR-T细胞阳性率检测结果，该结构中使用了来源于CD19抗体FCM63克隆的scFv，因此可通过抗FMC63 scFv抗体对其转染效率进行检测，结果表明CD19 CAR-T细胞的阳性率可达45.59%，表明成功构建了阳性率较高的CD19 CAR-T细胞。

构建好CAR-T细胞即可进行相关的药效评价，通常采用不同的效靶比，观察CAR-T细胞对靶细胞的杀伤作用。我们将CD19 CAR-T细胞和T细胞分别以不同效靶比同Nalm6细胞共孵育48h，采用流式法检测肿瘤细胞凋亡。如图所示，与T细胞组相比，不同效靶比条件下，CD19 CAR-T细胞均展现出了对Nalm6细胞明显增强的特异性细胞毒性作用。