孟飞龙/叶菱秀团队解开40年难题，揭示DNA柔性在抗体基因超突变中的作用

胞苷脱氨酶AID是一种仅含198个氨基酸的蛋白质。体外分析表明，AID作用于单链DNA底物，且偏好作用于WRC（W=A/T，R=A/G）基序。然而，脱氨酶基序并不能解释体细胞超突变的CDR偏好性，因为同样的WRC基序也存在于抗体可变区内的骨架区（FR），而且广泛分布在基因组中。这些结果提示一些中尺度（5-50 bp）水平的元件可以增强特定WRC基序上的超突变。

研究人员从经典的生化方法出发，联合高通量测序技术，建立了体外检测AID脱氨酶活性的新方法（图1）。他们使用了一段124-nt的单链DNA底物，覆盖小鼠VHB1-8外显子中的FR3-CDR3序列，这段序列在体内表现出WRC突变偏好。他们发现，体内CDR高突变特征可以在体外AID脱氨酶活分析中完全重现。

 体外AID脱氨酶活分析重现了体细胞超突变图谱^[1]

接下来，他们将生化分析的DNA底物扩展到27种有颌脊椎动物的1084条抗体基因序列。他们发现，在使用体细胞超突变作为抗体多样化策略的动物中，包括人、恒河猴、食蟹猴、小鼠、大鼠、狗、鸭嘴兽及羊驼等，CDR突变偏好高度保守。相比之下，一些采用基因转换机制的物种，如鸡、牛、羊和猪等，则并未表现出如此强烈的偏好。

那么，这种突变偏好是否受DNA序列背景的影响？为了检验这一点，研究人员构建了一个携带IgV_H-乱序等位基因的小鼠模型，其中每个CDR或FR的一个WRC（AGCT/AGCA）基序被保留在相同位置，而六个WRC基序周围的序列被随机置换。他们发现，在序列改变后突变频率发生了显著变化。这表明不同的DNA序列背景中可能存在中尺度的元件，增强或抑制WRC突变。

于是，他们利用CRISPR-Cas技术构建了11种携带不同CDR3序列背景的小鼠模型。他们发现，其中6个模型的C/G核苷酸突变频率降低，而1个模型的突变频率升高。值得注意的是，序列改变越靠近WRC基序，则对该位点的突变频率影响越大。这些结果表明，周围序列背景决定了体内WRC基序的突变程度。

为了绘制AID和单链DNA底物的潜在相互作用，研究人员在poly（dT）或poly（dA）的背景下对AID和AGCT底物进行了分子动力学模拟。他们发现，在T底物中观察到的相互作用在A底物中大大减弱，表现出一种截然不同的结合模式（图2）。模拟出来的结合与AID在不同底物上的脱氨活性一致，因为在T底物上的活性高于A底物。因此，他们认为AID与ssDNA骨架的静电相互作用决定了脱氨的优先顺序，而ssDNA碱基序列可能会间接影响结合。

脱氨优先顺序与AID-ssDNA相互作用有关^[1]

之后，他们探讨了相关的物理特征，包括poly（dT）和poly（dA）在DNA柔性上的差异，其中poly（dT）最柔韧，而poly（dA）最僵硬。通过一系列分析，他们发现AID脱氨酶基序相邻序列的柔性会影响AID脱氨酶的活性。中尺度DNA序列的柔性越大，越有利于结合AID表面的正电荷片区，进而有助于突变的发生。单链DNA的柔性与嘧啶-嘧啶（Py-Py）二核苷酸的含量呈正相关。

通过分析抗体基因序列特征，研究人员发现CDR中的序列特征可能在密码子或非编码DNA水平上经过了进化选择。他们发现CTA和ACT等基序（即TAC相关基序）在CDR中高度富集。他们将相关柔性序列插入抗体基因突变低频区FR3中，构建了序列改变的IgV_H-FR3^TAC乘客等位基因小鼠模型（该模型由赛业生物提供），发现柔性序列极大地提高了FR3区域的突变频率，可将突变“冷区”转变为突变“热区”。

DNA柔性在抗体基因超突变中的作用^[1]

总的来说，这项研究揭示了CDR区域发生高频突变的分子机制，其中高密度的WRC基序和中尺度的DNA柔性都有助于CDR区域发生超突变。研究结果表明了抗体编码序列在指导超突变中的非编码作用，为设计下一代抗体基因人源化动物模型奠定了基础。