无需多次动物实验，Nature新技术让KO细胞大有可为

研究人员通过慢病毒转染的方式进行敲除，提高转染效率的同时，将Cas基因整合到基因组中，通过增加Cas蛋白和sgRNA在细胞内的存留时间来提高细胞敲除效率。但慢病毒感染存在着两个比较关键的问题：

为了降低脱靶效应，采用的策略是减少Cas蛋白与sgRNA复合物在细胞中的存留时间，因此我们还可以采用质粒法进行KO细胞的构建。即通过将Cas和sgRNA表达载体瞬时转染到目的细胞中，从而在细胞内表达Cas蛋白和gRNA，由于质粒整合到基因组的概率极低，随着细胞传代质粒载体的逐渐消失，再经过PCR验证和测序筛选出纯合的敲除细胞。但质粒法也存在一个较大的问题，即转染效率较低。

与质粒法不同的是，RNP法是通过电刺激转染的方法直接将Cas蛋白和sgRNA复合物转染到细胞中。由于Cas蛋白是不带电荷的，而sgRNA是带电荷的，因此只有当Cas与sgRNA结合后，才能更高效地将两者转染到细胞中。同时，由于Cas和sgRNA会被降解，Cas-sgRNA复合物在细胞内的存留时间不会很长，因此发生脱靶的概率很低。从国内外文献报道的情况来看，质粒法和RNP法是目前主流的基因敲除策略，对于生物技术企业来说，RNP法具有更高的实验效率。