Sci Transl Med丨英国学者构建新模型来探索肌张力障碍的病理生理学

研究人员此次重点研究了肌张力障碍的最常见遗传形式：早发型扭转性肌张力障碍（DYT1-TOR1A），它通常是由TOR1A基因5号外显子中三对碱基的框内缺失引起的，TOR1A基因编码产生了内质网腔蛋白torsinA。于是，他们委托赛业生物构建出Tor1a-frt小鼠，并将其与Cdx2::FlpO小鼠杂交，产生了双等位基因“双”条件性敲除Tor1a小鼠（d-cko）。通过qPCR和Western blot分析，他们发现Tor1a在小鼠脊髓和背根神经节中几乎没有表达。

之后，他们筛选了torsinA功能异常的超微结构特征——核膜（NE）畸形。神经元中经典的torsinA表达分布在整个内质网和核膜中，但突变的torsinA会在核膜上异常积累。从形态上看，这会导致核外膜突起，而且这些突起以囊泡的形式释放。他们通过电镜观察到，Tor1a缺失的腰部脊髓神经元充满了核膜异常，后角处的部分神经元表现出囊泡堆积，且核膜明显分离，而侧角处的几乎所有脊髓神经元都受到了影响。这些数据证实，这种新的小鼠模型将Tor1a d-cko限制在脊髓和背根神经节，且脊髓神经元表现出torsinA功能缺失的超微结构特征。

为了验证脊髓Tor1a d-cko小鼠模型是否会出现早发型扭转性肌张力障碍，研究人员开展了一系列实验。他们发现，脊髓Tor1a d-cko小鼠重现了人类重症疾病的表型，出现了早发型扭转性肌张力障碍。运动障碍很早就出现在小鼠后肢，之后逐渐向两侧扩散。到第7-9天，小鼠的骨盆、躯干和前肢都出现了明显的运动障碍。到第19-21天，脊髓Tor1a d-cko小鼠出现了严重的肌张力障碍，姿态极度异常，肢体运动紊乱（图1）。

通过肌电图分析，他们观察到脊髓Tor1a d-cko小鼠在静止时有过度的自发肌肉活动，包括拮抗肌长时间的共活动电位。同时，这些小鼠在自主运动时表现出过度和无序的收缩。这些数据表明，脊髓限制性Tor1a功能障碍会直接造成早期发病的全身性肌张力障碍，其特征是静止时持续的自发肌肉活动以及静止和自主运动时过度的协同收缩。

脊髓限制性Tor1a d-cko导致小鼠出现早发型的运动失调^[1]

接下来，研究人员需要确定，Tor1a缺失的脊髓回路是否是过度自发活动和无序运动输出的主要来源。考虑到后肢是脊髓Tor1a d-cko小鼠发病的主要部位，而腰椎是控制后肢运动的神经中枢，他们从小鼠身上分离出腰椎脊髓，并记录了来自伸肌和屈肌相关脊髓运动池的电生理活动。他们发现，来自P3-P5脊髓Tor1a d-cko小鼠的所有离体脊髓都存在自发活动，在大部分自发活动中，伸肌相关和屈肌相关运动池共同激活（图2）。这些结果表明，通过肌电图记录到的脊髓Tor1a d-cko小鼠的自发活动可能来自脊髓回路的自发活动。

为了确定脊髓Tor1a d-cko如何从根本上改变神经输出，他们开展了小波变换（wavelet transformation）分析。P1期的脊髓Tor1a d-cko小鼠表现出高功率的频谱，而P3期小鼠的频谱出现紊乱，放电频率下移，到了P5期，主要功率频带降至0.016 Hz（图2）。这些数据揭示了Tor1a缺失的脊髓回路会直接在静止时产生过度的自发活动，并在运动时产生无序的运动输出。

Tor1a缺失的脊髓回路产生过度自发活动和无序运动输出^[1]

考虑到脊髓回路出现功能障碍，研究人员接着验证了最基本的脊髓回路：单突触反射。病例报告显示，全身性肌张力障碍患者表现出单突触反射幅度减弱，因此，他们系统评估了脊髓Tor1a d-cko小鼠在P7到P13阶段的腰神经根单突触反射。结果显示，这些小鼠最尾部的脊髓反射最早出现异常，随着年龄的增加，单突触脊髓反射损伤向小鼠头部扩散。这些数据表明，在出生后的成熟过程中，单突触脊髓反射损伤会从尾部向头部发展。

之后，他们从该反射弧的四个组成部分入手，深入探索了单突触反射受损的机制。他们重点研究了腰椎尾部运动池，因为它们最早受到影响。他们发现，脊髓Tor1a d-cko小鼠的运动神经元较小，全细胞电容降低，输入电阻增加，表明腰部运动神经元直接受到Tor1a缺失的影响（图3）。接下来，他们通过背根的低阈值刺激重点研究了传入神经的反射。与对照组相比，这些小鼠的传入诱发的兴奋性突触后电流（EPSC）振幅降低，持续时间延长，并出现多个异步峰值。总之，单突触反射弧的所有部分，从感觉传入的动作电位传导到运动神经元再到运动神经根本身的传出输出，都容易受到Tor1a功能缺失的影响，并导致Tor1a d-cko小鼠的感觉运动整合功能受损。

脊髓限制性Tor1a d-cko导致小鼠出现早发型的运动失调^[1]

总的来说，这项研究表明，脊髓回路功能障碍在DYT1-TOR1A肌张力障碍的病理生理学中发挥了关键作用。小鼠脊髓和背根神经节中Tor1a的缺失足以重现人类重症患者的表型，且进一步分析显示，脊髓运动回路和单突触反射弧在Tor1a缺失后受损，表明脊髓神经回路的缺陷可能导致肌张力障碍的多个症状。

赛业生物致力于更好地服务客户，可为您构建Tor1a基因敲除小鼠与条件性基因敲除小鼠，现已加入『红鼠资源库』，快来选购吧！