Bone Research: PDGFR-β通过增加依赖于H型血管的异常软骨下骨生成促进骨关节炎

骨关节炎发病过程中，软骨下骨的PDGFR-β表达升高[1]

该研究首先采用了前交叉韧带切除手术（ACLT）诱导创伤后骨关节炎小鼠与假手术小鼠对比，使用Westren Blot技术显示出在OA患者的骨关节软骨下骨PDGFR-β的表达量会显著增加。其次使用了番红染色、细胞免疫染色技术发现，ACLT术后小鼠软骨下骨的软骨细胞量会减少且PDGFR-β表达显著增加。

PDGFR-β在CD31 ^hiEmcn^hi ECs中高表达[1]

首先qRT-PCR技术对从骨髓中取出的CD31 ^hiEmcn^hi ECs和CD31 ^loEmcn^lo ECs中PDGFR-β进行了检测，结果显示PDGFR-β在CD31 ^hiEmcn^hi ECs中表达较高。随后通过FACS技术从OA术后4周、OA术后8周和空白组小鼠中分选软骨下CD31 ^hiEmcn^hi ECs。再使用qRT-PCR、细胞免疫荧光染色技术，结果显示骨关节炎小鼠的CD31 ^hiEmcn^hi ECs与PDGFR-β都会显著升高。

PDGFR-β基因敲除小鼠关节炎进程减缓[1]

为了探究骨关节炎进程是不是与PDGFR-β有关，研究采用了LoxP-flanked PDGFR-β和Cdh5-Cre小鼠（由赛业生物提供）构建PDGFR-β基因敲除小鼠进一步验证，使用SOFG染色、HE染色、免疫荧光染色技术，分别对OA术后4周和8周的PDGFR-β^-/-与PDGFR-β^lox/lox小鼠进行染色，对比软骨下骨化程度、软骨退化程度和MMP13、Sox9、ADAMTS5、ColII、Aggrecan的显影，结果表明PDGFR-β基因敲除小鼠的骨关节炎发展进程明显减缓。

PDGFR-β^-/-小鼠软骨下CD31 ^hiEmcn^hi ECs减少[1]

研究为了验证CD31 ^hiEmcn^hi ECs表达是否受到PDGFR-β影响，研究继续在PDGFR-β基因敲除的小鼠中验证，首先通过FACS从不对条件处理的PDGFR-β^lox/lox和PDGFR-β^−/−小鼠中分离CD31 ^hiEmcn^hi ECs。再通过qRT-PCR和细胞免疫荧光染色技术，验证出敲除PDGFR-β后CD31 ^hiEmcn^hi ECs表达将减少。

PDGFR-β通过形成PDGFR-β/talin1/FAK复合物在体内发挥作用[1]

为了探究现象背后的潜在机制，该研究使用了LC-MS/MS在BMEC中分析鉴定出了PDGFR-β结合蛋白FAK和TLN1。再通过免疫共沉淀技术确定了PDGFR-β与FAK、TLN1相结合。最后通过蛋白印迹技术，检测PDGFR-BB或FAK抑制剂或TLN1 siRNA处理的BMEC中FAK、TLN1和VEGF表达情况。结果显示PDGFR-BB可以激活PDGFR-β复合物并具有时间和剂量依赖性，而FAK抑制剂和TLN1都会抑制VEGFR表达。

PDGFR-β/talin1/FAK复合物促进血管生成[1]

为了进一步确认PDGFR-β/talin1/FAK复合物在血管生成中起到的作用。通过携带PDGFR-β基因病毒转染的方式，超表达和抑制PDGFR-β。使用ELISA技术确认VEGF在不同病毒转染的BMECs的表达情况，在试管形成实验中设置PDGFR-β过表达组、PDGFR-β抑制组、talin1抑制组和FAK抑制组研究BMECs的总回路、总分支点和总长度。再通过CCK-8和划痕实验检测以上条件下BMECs的增殖和运动量化分析。结果表明PDGFR-β通过与talin1、FAK形成复合物的形式来促进血管的生成。

内源性PDGFR-β可以抑制骨关节炎进程[1]

为了探索内源性PDGFR-β对于OA的影响，通过注射AAV9抑制内源性PDGFR-β在ACLT处理后小鼠的表达。使用免疫荧光技术对endomucin，CD31和LepR或Nestin染色，结果显示抑制PDGFR-β可以缓解ACLT术后小鼠关节炎病程。同时可以使OA小鼠骨小梁模式因子、软骨下骨骨板厚度、骨量/总组织体积和小梁骨数情况逆转趋向正常。并且研究通过SOFG染色技术显示出抑制PDGFR-β可以减缓软骨的降解。

综上，目前的研究显示，研究者发现PDGFR-β在OA患者、老年小鼠和创伤性OA小鼠的软骨下骨中显著升高，并且PDGFR-β主要在软骨下骨中的CD31 ^hiEmcn^hi ECs表达。值得关注的是，在软骨下骨局部注射AAV9抑制内源性特异性PDGFR-β后，异常的基于H型血管的骨形成和骨关节炎进程都缓解了。除此之外，该研究还发现了在PDGFR-β基因敲除小鼠的PDGFR-β会在ACLT术后4周后开始升高，这表明ACLT后升高的PDGFR-β可能有其他来源如周皮细胞。作者认为在OA的刺激下，软骨下单核破骨细胞前体释放出大量的PDGFR-BB，与CD31 ^hiEmcn^hi ECs与周皮细胞上的PDGFR-β相结合，促进了周皮细胞向CD31 ^hiEmcn^hi ECs募集，共同促进了在骨关节炎中基于异常H型血管的软骨下骨形成。

总而言之，PDGFR-β通过PDGFR-β/talin1/FAK通路促进H型血管的形成并导致异常的骨形成，并且抑制PDGFR-β或使其失去功能可以缓解骨关节炎的病程，此外，研究提供了在骨关节炎发展过程中内源性PDGFR-β调节血管形成与骨形成的机制。因此，PDGFR-β被确定成为了骨关节炎潜在有效的新靶点。