KO细胞株一文通（下）：4大常见问题详解

上期我们说到了KO细胞株的基础概念、应用、优势和操作指南，这期就给结合实践过程中最常遇到的四大问题给大家做一下讲解。可以收藏再看，也可以点击下载手册「基因编辑细胞系常见问题解答」，覆盖基因编辑细胞30+常见问题，随查随用。

Q1：实现基因loss of function，我是要做敲低（RNAi）还是敲除？

• 当敲除可能会导致细胞增殖非常缓慢或停止生长，或在细胞转染后的cellpool阶段检测效率呈显著下降趋势，即可判定可能出现敲除致死的情况，建议用RNAi。
• 由于存在部分强功能蛋白，即使表达下调了，仍然有较强的功能，如果RNAi始终做不出表型，但从有关信息推测这个基因很大可能性会出表型，建议做KO；另外，研究的目的基因处于非转录区域，或者目的基因有很强的转录效率，也是无法用RNAi进行有效干扰的，则建议做KO，且KO细胞更适合进行回补实验。
• 最后，敲低跟敲除不是二选一的关系。当我们用RNAi做了基因敲低，观察到细胞表型的变化后，仍然可以进一步做敲除，让实验结论更加有说服性。

Q2: 测序没问题，但一直出现蛋白残留的原因是？

可能的原因有：

（1） Western Blot抗体的选择不合适

（2）基因的可变剪切引起的蛋白残留

（3）由于目的基因的多转录本引起的蛋白残留

（4）目的蛋白本底表达低

（5）遗传补偿效应：无义突变和同源序列

参考Western blot trouble shooting思路图进行原因排查

• 细胞和基因信息分析

（1）确保细胞和基因的准确性。

（2）核对敲除策略和gRNA设计位置，确保gRNA设计在保守区域且尽可能覆盖所有转录本。

（3）分析目的基因是否有同源基因，如有同源基因可能会存在遗传补偿效应。

（4）分析目的基因在宿主细胞内的本底表达水平，相应调整Western blot参数。

• DNA水平分析

（1）检查鉴定策略是否合适，PCR电泳条带与预期是否一致。

（2）核查测序原始数据，测序质量是否合格，分析测序结果检查是否还有未敲除干净的序列，与野生型序列进行比对确保敲除成功。

• mRNA水平分析

（1）使用RDDC（https://rddc.tsinghua-gd.org/）对突变进行可变剪切预测，如产生移码和提前终止，则认为mRNA水平敲除合格。

（2）提取细胞mRNA进行cDNA PCR和测序，并与野生型进行比对，确定mRNA水平是否敲除成功。

• 蛋白水平分析

根据DNA测序结果，使用相应软件将KO后的DNA翻译成氨基酸序列，并与野生型氨基酸序列进行比对，确定氨基酸水平是否发生敲除。

• 抗体分析

KO验证和文献验证更优，比对抗体免疫原位点与敲除区域位点，免疫原位点C端优于N端，核对抗体是单克隆或者多克隆，单克隆优于多克隆；抗体的品牌，进口优于国产。

Q3: 基因敲除的sgRNA如何设计？

在CRISPR-Cas9系统中，sgRNA通过碱基互补配对原则引导Cas9蛋白酶至基因组特定的靶序列上，Cas9蛋白与PAM序列结合后便可对靶位点进行切割，形成DNA双链切口。sgRNA设计的合理与否，对于CRISPR-Cas9编辑系统的切割效率，甚至最后能否得到KO细胞具有重要影响。目前虽然有诸多高效快速的gRNA设计工具，但我们仍需了解基本的设计原则才能更好地做出判断。sgRNA的设计需要遵循以下原则：

1.不影响其他基因，尤其是编码蛋白的基因。挑选靶区域时应避免选择与其他基因重叠的区域。

2. 尽可能影响所有的转录本，敲除位点最好在编码区的前50%，但避免敲除ATG所在外显子或ATG之前的外显子。

3. 片段敲除的sgRNA设计在内含子上，这样能敲除整个外显子区，避免翻译出残留蛋白。敲除区域前后序列尽量简单，方便后续的PCR鉴定。同时敲除的外显子编码序列之和为非3的倍数，使靶区域后面的序列发生移码。

4. 在设计sgRNA时要综合考虑候选编辑位点的序列、位置、正负链、GC含量、潜在的脱靶位点等信息。例如靶点的GC%尽量不要低于40%，靶点序列GC%偏高（50%~70%）有较高的打靶效率；靶点内不要有连续4个以上的T碱基，避免形成RNA Pol III的转录终止信号等。

KO细胞株构建过程较为繁琐，包括sgRNA设计、载体构建等多项步骤，实验周期长。基于Smart-CRISPR™细胞基因编辑系统，已全面启动全基因组敲除细胞库构建计划，可智能化计算得到低脱靶高效率的gRNA，确保实验成功率，更有现货快至一周发货。

Q4：筛选出了很多单克隆杂合子，但无法筛选出纯合子？

在细胞转染后，进行单克隆的筛选的时候出现了无法筛到纯合子的情况，原因可能有以下三点：

• sgRNA切割效率过低。
• 初筛没有纯合子，先考虑是否存在WT/纯合子/杂合子的混杂细胞，如果没有混杂的情况，则可能是基因本身的问题。
• 敲除的靶基因对细胞的生存和增殖有巨大影响，敲除后能导致细胞无法存活。

如果你还想了解更多KO细胞构建的知识点，如：

• 如何选择最有效的细胞转染方法？
• CRISPR-Cas9系统的活性检测方法有哪些？
• 针对细胞外或细胞内，检测脱靶的方法分别有哪些？