Cell（IF=45.5）：苏州大学团队揭示乳酸化如何促进肿瘤发生

研究人员在评估TCGA乳腺癌数据集后发现，对于携带野生型p53的患者，血清乳酸水平高对应着p53信号通路评分明显较低，这表明肿瘤中的乳酸可能会抑制p53的功能。为了研究乳酸在体内的作用，他们在接种MMTV-PyMT肿瘤细胞的小鼠体内注射乳酸钠。结果表明注射乳酸钠会导致肿瘤更早形成，体积明显增大，且肿瘤内p53活性明显受到抑制。

乳酸脱氢酶A（LDHA）将丙酮酸转化为乳酸，其高表达与乳腺癌患者的生存率低有关。为此，研究人员将MMTV-PyMT/MMTV-Cre⁺小鼠与Ldha^fl/fl小鼠（由赛业生物提供）杂交，造成动物乳腺上皮中Ldha的组成型缺失。值得注意的是，LDHA的缺失导致肿瘤形成延迟、肿瘤乳酸和肿瘤负荷降低，且p53活性增加。此外，阻断乳酸的产生可导致肿瘤细胞中p53靶基因的表达显著增加。这些结果表明，肿瘤来源的乳酸是p53的天然抑制剂，可促进p53乳酸化。

为了鉴定负责p53乳酸化的蛋白质，研究人员在HeLa细胞中开展了全基因组CRISPR筛选。在此次筛选中，丙氨酰tRNA合成酶1（AARS1）被确定为最强的候选基因（图1）。之后，他们分析了全局赖氨酸乳酸化组，发现AARS1敲降抑制了乳酸诱导的乳酸化组；相反，过表达AARS1则强烈加强了整体的赖氨酸乳酸化组，表明AARS1介导了细胞中的全局赖氨酸乳酸化。

AARS1在多个物种中是保守的，包括大肠杆菌。细菌对应酶EcAlaRS的过表达也加强了整体的赖氨酸乳酸化组（图1）。在比较人类HsAlaRS和细菌EcAlaRS后，他们发现两者的目标位点和蛋白质存在大规模重叠。根据这些结果，研究人员推测AARS1可能在催化赖氨酸乳酸化过程中发挥了古老的作用，从原核生物到哺乳动物，这种作用都是保守的。

图1 全基因组CRISPR筛选确定AARS1介导了赖氨酸乳酸化^[1]

那么，AARS1如何介导乳酸化呢？研究人员发现，EcAlaRS和HsAlaRS可直接与乳酸结合，以乳酸作为底物直接催化乳酸化。分子对接分析表明，HsAlaRS中的保守残基（M46、R77、N216和D239）和EcAlaRS中的保守残基（M43、R69、W170、N212和D235）与乳酸形成直接接触。不过，只有在乳酸和ATP同时存在的情况下，AARS1才会增强细胞裂解液中的赖氨酸乳酸化。

质谱数据表明，AARS1与p53相互作用；体外分析也表明，HsAlaRS和EcAlaRS直接与p53结合。p53蛋白的第120位赖氨酸（K120）和第139位赖氨酸（K139）被乳酸化（图2）。在体外，野生型的HsAlaRS和EcAlaRS（而不是乳酸或ATP结合缺陷突变体）在K120和K139处对p53进行乳酸化，这些反应可被β-丙氨酸抑制。

据此，研究人员提出：首先，AARS1中的乳酸被ATP分子激活，形成中间产物乳酸-AMP，并释放出无机焦磷酸（PPi）；其次，活化的乳酸与赖氨酸受体端共价连接，并释放出AMP。与此相一致的是，在将乳酸和ATP与AARS1共同孵育后，他们检测到乳酸-AMP的形成和PPi的释放。因此，他们推断AARS1通过催化ATP依赖性的乳酸-AMP形成，将乳酸转移到目标蛋白的赖氨酸残基上（图2）。

图2 AARS1催化ATP依赖性的乳酸与赖氨酸结合^[1]

接下来，研究人员分析了位于DNA结合结构域的K120和K139的乳酸化如何抑制p53的活性。他们生成了p53变体，这种变体携带了组成型乳酸化的赖氨酸残基。与非乳酸化p53（p53NonLac）相比，p53Lac与含有p53应答元件的DNA（p53RE-DNA）的亲和力大大降低，这会抑制p53的液-液相分离（LLPS）和转录活性。体外和体内分析证实了这些结果，表明位点特异性的乳酸化会降低p53的肿瘤抑制作用。

之前的研究发现p53存在与癌症相关的突变热点，包括K120N、K120E、K139T、K139Q等。赖氨酸突变为天冬酰胺、苏氨酸、谷氨酰胺，尤其是谷氨酸，会降低其正电荷，并模拟相应赖氨酸残基的乳酸化。研究人员发现，这些突变体与p53RE-DNA的结合亲和力降低，尤其是K120E和K139E，而且突变体不能抑制细胞增殖、克隆形成和异种移植肿瘤生长，进一步证实了p53乳酸化在肿瘤进展中的潜在作用。

AARS1在许多肿瘤类型中的表达都升高，并与WT p53患者的生存率不佳有关。为此，研究人员将Aars^fl/fl小鼠（赛业生物提供）与MMTV-PyMT/MMTV-Cre⁺小鼠杂交，生成乳腺上皮细胞缺失AARS的小鼠，并评估AARS1表达减少的影响。与野生型小鼠相比，AARS1表达减少的小鼠患肿瘤的时间更晚，且肿瘤负荷也更低。在这些小鼠的肿瘤中，p53在K120和K139处的乳酸化减少。这些结果表明，AARS1在体内介导p53失活并导致肿瘤发生。

考虑到β-丙氨酸（一种常用的运动补充剂）是乳酸的类似物，他们推测其能破坏乳酸与AARS1的结合。在动物模型中，β-丙氨酸处理可适度抑制细胞增殖、克隆形成和异种移植肿瘤生长。多柔比星（激活p53的癌症治疗药物）可以增强上述效果。经过β-丙氨酸和多柔比星处理，小鼠寿命显著延长。由此可以推断，β-丙氨酸可防止乳酸化依赖性的p53失活，表明它具有治疗潜力。

图3 AARS1介导肿瘤细胞中的p53乳酸化并促进肿瘤发生的示意图^[1]

总的来说，这项研究发现肿瘤产生的乳酸通过乳酸化对抗p53。AARS1是一种乳酸感知器，负责全局赖氨酸乳酸化。该研究还确定p53的K120和K139是AARS1的真正靶点，并证明乳酸化会阻碍p53液-液相分离、DNA结合和转录激活，从而导致肿瘤发生（图3）。研究人员认为，全面了解AARS1的功能及其功能失调的后果有望从机理上认识多种人类疾病。

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