PCR鉴定无阳性，都是小鼠的错？

如果你花重金等了数月的基因编辑小鼠到手后，PCR鉴定却无阳性结果，相信你的内心肯定是崩溃的。满怀期盼地等了那么久，小鼠PCR鉴定居然有问题？是我买的小鼠有问题吗？

且慢，找小鼠算账之前先冷静一下，想想自己的鉴定方案和操作是否有问题。不然草草地下结论，冤枉了小鼠怎么办呢。

那么不同的基因编辑小鼠应该怎么鉴定呢？

一般来说，为你制备基因编辑小鼠的机构给你的鉴定报告里都会有鉴定的方案及结果，你按照它的方案来做就行了，不过咱们还是得知道为什么要这样鉴定，才能知其然，知其所以然。这样遇到问题时，才有正确的解决思路和方案。

以现在比较热门的 CRISPR/Cas技术制备的各类基因编辑小鼠为例，不同类型的小鼠鉴定方案是不一样的。

★ 基因敲除小鼠 ★

1、基因敲除阳性鼠的鉴定

在敲除的片段两端设计引物，扩增后电泳。理论上敲除成功的小鼠扩增出的片段大小=野生型小鼠的片段大小－敲除的片段大小，所以可通过电泳图的条带大小来进行鉴别，但实际上，若敲除的片段过大，有的酶是扩增不出来野生型片段的，比如有的酶，1.5K以下基本可以P出条带，大于1.5K的大部分是P不出的，所以当野生型的条带无法扩增时，这对引物就不能鉴定纯杂合了。

1.1、野生型片段扩增不出来时

敲除的片段较大时，野生型相应的片段往往扩增不出来。电泳结果若是无条带，则为野生型；若是只有一条条带，则为敲除小鼠（纯合或杂合）。

PS:条带大小=野生型片段大小-敲除片段大小

1.2、野生型片段可以扩增出来时

假设

条带1大小=野生型条带大小

条带2大小=野生型片段大小-敲除片段大小

当野生型的片段可以扩增出来时，电泳结果若是只有条带1，则为野生型；若是既有条带1又有条带2，则为杂合敲除小鼠；若是只有条带2，则为纯合敲除小鼠。所以这种情况就不需要再设计引物鉴定纯杂合了。

2、基因敲除小鼠纯/杂合鉴定

假设
条带a大小=引物F及引物Wt/He-R扩增的片段大小
条带b大小=野生型片段大小-敲除片段大小

同个line的杂合敲除小鼠互配的后代会有三种表型：野生型、纯合子、杂合子，需要鉴定纯杂合。由于敲除片段过大时，上文鉴定基因敲除阳性鼠设计的引物往往无法鉴定纯杂合，所以需要再设计一条引物在敲除片段上（靠近5’端或是3’端）。电泳结果若是只有条带b，则为纯合敲除小鼠；若是a，b两条条带都有，则为杂合敲除小鼠。

★ 基因插入小鼠 ★

针对大片段的基因敲入，F0代阳性鼠的鉴定分为三步。

第一步

在5’同源臂及3’同源臂设计引物测同源臂序列。设计两对引物，一对位于靠近5’同源臂的基因组及插入片段（5F和5R）上，一对位于靠近3’同源臂的基因组及插入片段（3F和3R）上。如果插入该片段成功的小鼠，其样本可以扩增出该片段，电泳结果有相应的条带；若插入失败，则扩增不出片段，电泳结果为没有条带。

第二步

验证是否发生了随机插入，即验证质粒上除了目的片段以外的其他片段是否随机插入到了基因组序列上，第一步验证出的阳性结果不能确定是否发生了随机插入。需要用一个阳性Donor（即插入了目的片段的Donor载体）作为对照，与第一步的验证类似，设计两对引物，一对引物位于质粒5’同源臂及载体的序列上，另一对引物位于质粒3’同源臂及载体的序列上。若是插入的片段包括质粒的其他部分，则电泳结果有目标大小的条带；若只插入了目的片段，则扩增不出来，电泳结果为没有条带

第三步

验证插入的片段的序列。如果插入的片段较小，则在插入片段两端设计引物，扩增电泳后切胶测序进行验证。

如果插入的片段过大，则需在插入的片段上分段设计引物去扩增，扩增后电泳，切胶测序进行验证。

需要注意的是，鉴于测序前后100bp左右测的不准，故R1,F2,R2,F3位置是交错的

★ 点突变小鼠★

1、点突变F0代阳性鼠鉴定

选择发生点突变的前后一段片段设计引物，设计引物时，还要考虑一下突变后是否有酶切位点，使酶切点两边的片段大小有区分，将扩增产物电泳后切胶测序，因为点突变的小鼠与野生型小鼠相比，片段大小没有太大区别，只有测序比对才能确定具体的碱基变化。

2、点突变F1代阳性鼠鉴定

选择发生点突变的前后一段片段设计引物，设计引物时，还要考虑一下突变后是否有酶切位点，使酶切点两边的片段大小有区分，将扩增产物电泳后切胶测序，因为点突变小鼠与野生型小鼠相比，片段大小没有太大区别，只有测序比对才能确定具体的碱基变化。

若是突变的点之后的序列正好是某种酶特异识别的位点，则可以用酶切实验进行验证。若是有突变，则酶可以特异性识别进行切割，否则酶无法识别进行切割。扩增电泳后回收DNA片段（比如切胶）进行酶切，酶切成功则发生点突变的片段被切为两段，野生型的不会被酶识别切割，可以从PCR图比对片段大小来确认是否酶切成功，进而确认该位点是否突变成功。

看了以上鉴定原理的介绍，你是不是觉得So easy ？But 还有很多坑埋在PCR操作过程中，所以下期我们会继续和大家聊一聊PCR失败的N种方法以及常见问题和建议。