一种胰蛋白酶原自发激活诱导慢性胰腺炎的临床前模型

原文标题：A preclinical model of chronic pancreatitis driven by trypsinogen autoactivation

期刊：Nature Communications

影响因子：11.878（2018年）

发表时间：2018年11月28日

选用服务：T7D23A点突变小鼠

研究背景：

以往的研究表明，编码消化蛋白酶或其抑制剂的基因若发生突变，则往往会促进急性胰腺炎的发生，并逐渐发展成慢性胰腺炎。例如，PRSS1（阳离子胰蛋白酶原）、CTRC（胰凝乳蛋白酶C）以及SPINK1（Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂1）的致病突变通过刺激自发激活或干扰保护机制，从而促进胰蛋白酶原转化成有害的胰蛋白酶。

不过，基因突变引起的胰腺内胰蛋白酶原自发激活具有直接致病作用，这虽然获得了大量的遗传和生化证据支持，但目前还缺乏适当的动物模型来证实。更重要的是，由于胰蛋白酶原自身激活所驱动的自发性慢性胰腺炎的动物模型的缺乏，这阻碍了针对胰内胰蛋白酶的治疗药物的临床前试验。

研究思路：

Step 1测定突变体的激活特性

研究发现小鼠组织中T7、T8、T9和T209亚型等四种胰蛋白酶原高水平表达，其中T7亚型占胰蛋白酶原总量的40-50%。为了产生T7亚型胰蛋白酶自发激活增加的T7突变体，研究人员在激活肽中引入了Ala突变，以取代Asp23（p.D23A）。体外检测T7 p.D23A突变体的激活特性，发现p.D23A突变改变了自身激活，而其他胰蛋白酶原激活和降解途径未受到影响。

图1. p.D23A突变对胰蛋白酶原T7亚型的影响

Step 2制备T7D23A点突变小鼠

将p.D23A突变引入小鼠基因组，制备T7D23A点突变小鼠。DNA测序表明，这些杂合小鼠在突变位点显示出两个高度相当的峰，表明野生型和突变型等位基因的表达水平相当。

Step 3慢性胰腺炎指标观察

胰腺形态及组织病理学观察

2-3周时胰腺形态是正常的，但4-5周时超过一半小鼠的胰腺变化较大，具体表现为胰管扩张和弥漫性间质纤维化等症状，并且伴有大量炎性细胞浸润，且小叶出现中心局部坏死，类似于慢性胰腺炎的症状。

图2.T7D23A小鼠的胰腺组织病理变化

T7D23A小鼠的血浆淀粉酶活检测

淀粉酶是诊断急性胰腺炎最常用的指标。因此，研究人员也测定了各个年龄的T7D23A小鼠血浆中的淀粉酶活性。在4-5周时，他们在约40%的小鼠中观察到淀粉酶值偏高，不过，他们在所有研究的小鼠中都不能捕捉到急性胰腺炎的指标。这可能与采样时间和发病年龄有关，也有可能不是所有的小鼠都会发展为急性胰腺炎。

Step 4机制验证

研究人员以3周龄（无病理变化）、4周龄（急性或早期慢性胰腺炎）和2月龄（晚期慢性胰腺炎）T7D23A小鼠为对象，测定了新鲜制备的胰腺匀浆液中的胰蛋白酶活性。结合突变p.D23A增加胰蛋白酶原自身激活的事实，实验结果支持了胰内胰蛋白酶原自身激活可导致急性胰腺炎的发生及随后发展为慢性胰腺炎的结论。

为了排除与胰蛋白酶原自发激活无关的疾病机制，研究人员还制备了p.D23A、K24G双突变的小鼠品系，除了带有杂合的T7D23A等位基因，胰蛋白酶原激活位点Lys24也经过突变。这种小鼠在5.5个月时没有出现自发的胰腺病理变化。这个结果提供了令人信服的证据，说明胰蛋白酶原错误折叠等机制并不引起T7D23A小鼠的表型，进一步支持胰蛋白酶原自身激活的致病作用。

Step 5与人胰腺炎的特征比较

研究人员认为，这种新模型概括了人类胰腺炎的临床疾病特点，它总是先发展为急性胰腺炎，然后再发展为不可逆的慢性胰腺炎。不过，他们没有观察到人类经常出现的急性病情反复发作。这种差异可能是由此处所用的胰蛋白酶原突变造成的。

结论：

该研究展示了第一个慢性胰腺炎的临床前小鼠模型，该疾病是由胰腺内胰蛋白酶原自发激活的增加所驱动的。这个模型概括了人类慢性胰腺炎的显著特征。在概念层面，这个模型提供了直接的体内证据，表明胰蛋白酶原的自发激活可驱动慢性胰腺炎的发作和发展，且治疗方法应针对胰腺内的胰蛋白酶。

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