《鼠年说鼠》第十六期：CRISPR/Cas基因敲入鼠如何鉴定？

《鼠年说鼠》系列文章，每周二更新，专门解答大小鼠铲屎官们在养鼠过程中经常遇到的繁育与鉴定类的问题，同时向大家征集问题，任何基因编辑鼠饲养繁殖或鉴定的困惑统统可以丢给小赛，小赛会给您回复或统一在后面的内容为大家做出详细的解答。

基因工程小鼠基因型PCR鉴定的基本原则是利用基因工程小鼠基因组与野生型小鼠基因组的序列差异，以小鼠基因组DNA为模板进行PCR，并以凝胶电泳对比不同基因型特异产物的大小，根据条带大小来区分小鼠的不同基因型。上期我们讲述了CRISPR/Cas条件性基因敲入鼠的鉴定，今天我们就开始学习CRISPR/Cas基因敲入鼠的鉴定。

验证F1代阳性鼠打靶是否正确

引物设计

为了验证外源DNA序列是否正确插入，两边同源臂是否打靶正确，使用F1/R1验证5'arm端，F2/R2验证3'arm端，也可再多设计一对位于插入区域内的引物。鉴定为阳性的鼠继续进行Southern Blot的验证。

预期片段大小

条带1的大小为：F1/R1扩增的5'arm端，包括野生型骨架区+同源臂+敲入区域；

条带2的大小为：F2/R2扩增的3'arm端，包括野生型骨架区+同源臂+敲入区域；

备注：条带1和条带2是对同源臂骨架区的验证，片段一般是2kb以上，扩增难度较大。赛业生物在交付之前会进行验证，您无需再进行验证。

电泳结果

若电泳结果同时有条带1、条带2，则为阳性敲入鼠。

若没有扩增出目的条带的则为阴性鼠（野生型或其它突变）。

测序

除了PCR鉴定，还需要将产物送测确认。F1/R1扩增产物的测序引物设在靠近loxP位点的5'arm上（图示中的F3），F2/R2扩增产物的测序引物设在靠近loxP位点的3'arm上（图示中的R3）。

纯/杂合的基因型鉴定

引物设计

交付的F1代小鼠已验证过同源臂打靶的正确性，现只需通过验证目的基因小于1kb的片段即可，设计一条引物位于敲入区域的上/下游，用于区分纯杂合。

预期片段大小

条带1的大小为：F4/R4扩增的野生型片段大小；

条带2的大小为：F4/R4扩增的插入片段大小+同源臂；

条带3的大小为：F5/R4扩增的部分插入片段大小+同源臂；

备注：使用短片段体系，如果插入片段过大，F4/R4可能是扩增不出来的。

电泳结果

若电泳结果只有条带3或者同时有条带2，则判断为阳性纯合鼠（KI/KI）；

若电泳结果只有条带1，则判断为野生鼠（+/+）；

若电泳结果有条带1和条带3或有同时有条带2，则为阳性杂合鼠（KI/+）。

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关于赛业

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