GAN饮食诱导的NASH小鼠的临床转化性

非酒精性脂肪肝疾病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种在无大量饮酒的患者肝脏中出现过量脂肪堆积而产生的类似于酗酒造成的肝脏损伤。而非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）是NAFLD 的一种形式，除了肝脏中过量的脂肪堆积外，还伴随着肝脏炎症和不同程度的肝脏损伤。尽管多数NASH患者并无明显症状，但NASH可能进一步发展为肝纤维化、肝硬化，甚至是肝癌。NASH在超重或肥胖的中年人群中比较常见，通常伴随着高血脂（胆固醇和甘油三酯水平升高）和糖尿病的出现。NASH发病机制复杂，目前还没有直接有效的药物，治疗方式主要是进行生活方式的干预，包括减轻体重、改变饮食、加强运动以及避免饮酒和服用不必要的药物等^[1]。因此，建立可靠的动物模型对探索NASH的发病机制及治疗手段十分重要。

Henrik等人通过构建Gubra-Amylin NASH (GAN) 饮食诱导肥胖 (diet-induced obese，DIO) 小鼠模型（GAN DIO-NASH小鼠），在体内模拟NASH患者中的肝脏纤维化，并对该模型进行了临床转化性的评估^[2]。

该研究使用含40%饱和脂肪、22%果糖和2%胆固醇的GAN饲料喂养C57Bl/6J小鼠38周以上，对代谢参数、血浆和肝脏的生物标志物进行了检测，同时，也对小鼠肝脏病理学特征和转录组特性进行了评估，并与体重正常的健康人和NASH患者进行了对比。

GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者的肝脏组织具有相似的病理学特征和量变

NASH 的主要病理学改变包括脂肪变性（steatosis），肝细胞气球样变（ballooning degeneration）、小叶炎症（inflammation）和纤维化（fibrosis）。虽然肝纤维化实际上并不参与NAFLD活动评分（NAFLD activity score，NAS），但纤维化程度可以用于预后评估。

肝脏组织切片显示，GAN DIO-NASH小鼠与NASH患者在脂肪变性、炎症病灶和肝细胞气球样变上具有相似的形态学特征（图1）。在GAN DIO-NASH小鼠肝小叶中，肝细胞脂质堆积呈分散式分布，主要表现为大泡性脂肪变性（macrovesicular steatosis）；且炎症病灶中浸润的免疫细胞主要是巨噬细胞和淋巴细胞形态的细胞。此外，在GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者中，肝小叶3区均能观测到肝细胞气球样变，且两者窦周隙胶原纤维的分布特征也相似。轻度纤维化（F1期）的GAN DIO-NASH小鼠主要表现为门静脉周围或窦周纤维化，F1期NASH患者则主要表现为窦周纤维化；而中度纤维化（F2期）的GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者都伴有门静脉/门静脉周围纤维化和窦周纤维化。

图1. GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者的肝脏组织具有相似的病理学特征。（图来源Ref.2）

肝活检病理组织学评分也表明，25只GAN DIO-NASH小鼠中有22只出现肝纤维化，且几乎都呈现轻度至中度纤维化（表1）。NAFLD活动评分也显示，NASH患者和GAN DIO-NASH小鼠具有相似的疾病严重程度（表2）。

表1. NASH患者和GAN DIO-NASH小鼠肝活检组织病理学评分的比较。（表来源Ref.2）

表2. NASH患者和GAN DIO-NASH小鼠NAFLD活性评分(NAS)的比较。（表来源Ref.2）

GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者具有重叠的肝转录组谱

主成分分析（Principal components analysis，PCA）显示，体重正常的健康人的肝脏转录组谱能与NASH患者的转录组谱清楚地分开，在小鼠中结果一样（图2A）。

而且在GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者的肝脏活检中发现了大量差异表达基因 (differentially expressed genes，DEGs)，且这些DEGs有着显著重叠（图2B）。基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）显示，这些基因主要与营养代谢、免疫功能和细胞外基质（extracellular matrix ，ECM）组织结构有关（图2C）。

图2. NASH患者和GAN DIO-NASH小鼠的肝脏转录组变化。（图来源Ref.2）

为了进一步探究GAN DIO-NASH小鼠和NASH患者中肝脏转录组的调控，研究者们对与NASH病理学和纤维化相关基因的RNA测序数据进行了分析。结果显示，与NASH患者相比，GAN DIO-NASH小鼠在七个既定基因组别中展现出葡萄糖代谢不足、脂质和胆汁酸处理受损、免疫调节受损、内质网 (ER) 应激、肝细胞损伤和ECM重塑活动的增强（图3A）。另外，通过分析28个编码NASH药物靶点的基因，研究者们发现它们可被归为3大类：脂质和葡萄糖代谢、炎症，以及ECM组织结构（图3B），且绝大部分基因在GAN DIO-NASH小鼠中都受到了明显的调控。

图3. NASH患者和GAN DIO-NASH小鼠中对疾病相关候选基因的调控。（图来源Ref.2）

GAN DIO-NASH小鼠表现出糖耐量受损

与普通饲料喂养的对照组小鼠相比，在实验终点，GAN DIO-NASH小鼠体重明显增加、全身脂肪量增加（肥胖），并出现肝肿大（图 4A-4D），糖耐量（glucose tolerance）受损（图 4E），高胰岛素血症（hyperinsulinemia）以及HOMA-IR 指数增加（图 4F-G），还伴随着高瘦素血症和高胆固醇血症（图4H-I）。此外，虽然GAN DIO-NASH小鼠血浆游离脂肪酸水平有显著升高（p = 0.05），但其血浆TG浓度并无显著变化（p = 0.75）（图4J-K） 。

图4. GAN DIO-NASH小鼠具有代谢综合征的特性。（图来源Ref.2）

GAN DIO-NASH小鼠血浆和肝脏的生化变化

对其他血浆和肝脏生化参数的分析结果显示，与普通饲料喂养的对照组小鼠相比，GAN DIO-NASH小鼠血浆中肝脏受损的标志物（ALT、AST）和纤维化的标志物 (total CK18、MMP-9、TIMP-1）水平均有显著升高，肝脏TG、TC和HP的浓度也有显著增长，但肝脏MMP-9的水平并没有显著增加（表3）。

表3. GAN DIO-NASH小鼠中血浆和肝脏的生化变化。（表来源Ref.2）

GAN DIO-NASH小鼠的血浆和肝脏中的细胞因子/趋化因子水平升高

对血浆和肝脏中的细胞因子/趋化因子水平的分析结果显示，与普通饲料喂养的对照组小鼠相比，GAN DIO-NASH小鼠血浆和肝脏中的TNF-α、KC/GRO和MCP-1浓度均有显著增长，特别是肝脏MCP-1。另外，GAN DIO-NASH小鼠血浆IL-6和IL-10，以及肝脏IL-1β和IL-5的浓度也有显著提高。

表4. GAN DIO-NASH小鼠血浆和肝脏中的细胞因子/趋化因子水平升高。（表来源Ref.2）

小结

综上，GAN DIO-NASH小鼠在生理、代谢和组织病理学方面都具有良好的临床转化性，可用于NASH发病机制的探索、潜在治疗靶点的确定，以及新药的研发。虽然可供选择的治疗靶点数目不少，在研药物也不少（表5），但还没有任何NASH药物获批。目前，奥贝胆酸（obeticholic acid，OCA）是唯一一个在关键3期临床试验中获得积极结果的药物。然而，在最近的试验中，OCA单一疗法只能使不到三分之一的患者获得NASH消退，因此，有研究者认为未来NASH的治疗还是需要依靠联合疗法^[3]。

表5. NASH药物临床试验信息（表来源Ref.4）

赛业生物NASH小鼠模型助力新药研发

赛业生物通过高脂高胆固醇高果糖饲料（GAN）喂养构建的NASH小鼠模型，可作为阐明非酒精性脂肪肝的病理生理机制以及新药的开发的动物模型。

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