【每周一鼠】病毒克星——Marchf2

Marchf2基因

Marchf2是膜结合E3泛素连接酶家族的成员。MARCH能将泛素添加到底物蛋白特定的氨基酸（如赖氨酸）上，从而使目标蛋白具有通过囊泡运输的能力。Marchf2能减少多种表面糖蛋白的累积，并能调控早期核内体向高尔基体的运输^[1]。

Marchf2可介导TFRC和CD86的泛素化，并促进内吞作用以及通过多泡体分选到溶酶体的过程。编码的E3-泛素连接酶以硫酯的形式接受来自E2-泛素结合酶的泛素，然后将泛素转移到目标底物上。除此之外，该蛋白可能通过与STX6的相互作用参与细胞内的囊泡转运^[2]。

图1. MARCHf2蛋白结构预测模型^[3]。

与Marchf2相关的疾病包括锁骨下动脉窃血综合征和肺曲菌球病。该基因的一个重要同源基因是Marchf3^[4]。

Marchf2基因敲除小鼠

Marchf2基因敲除纯合小鼠对细菌或病毒感染具有更高的的抵抗力，接种细菌或病毒后其载量更少，敲除小鼠的细胞因子产生增加，但脂多糖诱导后致死率增加^[5]。

研究人员为了评估Marchf2在先天免疫反应中的作用，使用CRISPR/Cas系统在C57BL/6背景的小鼠上敲除Marchf2基因，产生了Marchf2^-/-小鼠，并验证了Marchf2的基因敲除。

Marchf2敲除小鼠没有表现出形态学的异常。研究人员为了进一步研究Marchf2在体内病毒感染中的作用，将VSV-GFP通过静脉注射到Marchf2^+/+和Marchf2^-/-小鼠中进行攻毒实验（图 2A）。结果Marchf2敲除小鼠的血清中病毒的载量要比Marchf2^+/+小鼠的血清中的少。

此外，研究人员在研究血清中细胞因子的含量时发现，Marchf2敲除小鼠血清中的IFN-β、IL-6、IL-12和TNF-α的浓度高于Marchf2^+/+小鼠（图2B）。此外，研究人员还向小鼠注射了病毒RNA模拟配体poly(I:C)，并检测了血清中细胞因子的表达水平（图2C），结果显示，使用配体进行刺激后，Marchf2敲除小鼠的血清中许多细胞因子表达水平高于Marchf2^+/+小鼠血清中细胞因子的表达水平。以上这些结果表明Marchf2参与体内抗病毒的免疫反应。

研究人员为了进一步研究Marchf2在响应细菌感染过程中的作用，研究人员用致死剂量的李斯特菌 (Lm)对Marchf2^+/+和Marchf2^-/-小鼠进行了攻毒实验。如图2D和E所示，Marchf2敲除小鼠比Marchf2^+/+小鼠更能抵抗细菌感染。

为了检查敲除Marchf是否会对病原体清除产生影响，我们使用菌落形成单位 (CFU) 滴定法检测了敲除小鼠和野生型小鼠中脾脏和肝脏中的细菌载量（图2F和G）。实验结果显示，Marchf2敲除小鼠两种器官中的细菌载量明显低于Marchf2^+/+小鼠中的载量。

接下来，研究人员探究了Marchf2敲除小鼠在攻毒后的低细菌载量现象是否是由于这些动物会产生更剧烈的炎症反应。研究人员将来自Marchf2敲除小鼠和Marchf2^+/+小鼠的血清、脾脏和肝脏样本中的细胞因子含量进行了检测比较，实验结果显示，来自Marchf2敲除小鼠组织中的IL-6、IL-12、CCL5和CXCL10都有较高的表达（图2H-J）。以上这些结果还显示Marchf2参与体内抗菌免疫反应的过程。

图2. Marchf2的敲除增强了体内的抗菌抗病毒免疫反应。

(A,B)向Marchf2^+/+ (n=8)或Marchf2^-/- (n=8)小鼠静脉注射VSV-GFP (2^*10⁸PFU/小鼠) 进行静脉内感染，并在感染12小时后收集血清样本. (A)使用噬斑试验分析病毒滴度。(B)使用ELISA检测了IFN-β、IL-6、IL-12和TNF-α的表达量。

(C)向Marchf2^+/+(n=6)或Marchf2^-/- (n=6) 小鼠静脉注射poly (I:C)（200微克/小鼠）。在感染后2小时收集血清样品，并用ELISA测量IFN-b、IL-6、IL-12和TNF-a的表达量。

(D-J)向Marchf2^+/+(n=8)、Marchf2^-/-(n=8)小鼠腹腔注射1*10⁶CFU的李斯特菌。(D) 显示了每组存活小鼠的占比，E图显示了体重变化。(F,G)研究人员在攻毒后3h，采集并检查了脾 (F)和肝脏(G)中的细菌的载量。

(H–J)研究人员检测了攻毒后24h每组小鼠血清(H)、脾(I)和肝脏(J)中炎症因子IL-6、IL-12、CCL5和CXCL10的表达量^[6]。

为了探究Marchf2是否与脂多糖(LPS)诱导的感染性休克有关，研究人员采用腹腔注射的方式将LPS打入Marchf2^+/+和 Marchf2敲除小鼠中。所有Marchf2^+/+小鼠都存活下来，而超过60%的Marchf2敲除小鼠死亡（图 3A 和 B）。这些结果表明Marchf2^-/-小鼠比Marchf2^+/+小鼠更容易受到内毒素休克的影响。

此外，脾脏切片的H&E染色显示Marchf2^-/-小鼠的炎症细胞浸润比 Marchf2^+/+小鼠更严重（图3C）。因此，研究人员猜测Marchf2参与LPS介导的感染性休克时的炎症反应。为了验证这个假设，研究人员使用ELISA检测了血清中多种细胞因子的表达量（图2D）。实验结果显示，与Marchf2^+/+小鼠相比，Marchf2^-/-小鼠多种细胞因子有着更高的表达量。总的来说，这些结果表明 Marchf2是针对病毒和细菌感染的先天免疫反应过程中的关键调节剂^[6]。

图3. Marchf2的敲除对LPS引起的感染性休克易感性的影响。

(A,B)向Marchf2^+/+ (n=8) 或Marchf2^-/- (n=8)小鼠腹腔注射LPS(24 mg/kg)。每组中存活小鼠的百分比和体重变化。(C) 向Marchf2^+/+ (n = 4)或Marchf2-/- (n=4)小鼠腹腔注射LPS (24mg/kg)。图片为各组脾脏切片及H&E染色的结果。D 向Marchf2^+/+ (n=6)或Marchf2^-/- (n=6)小鼠腹腔注射LPS (24mg/kg)，并通过ELISA在12hpc时测量各组小鼠血清中IL-6、TNF-α、CXCL-10和CCL-5的水平。

小结

在感染的后期Marchf2能和NF-κB调控因子（NEMO）相互作用，并进一步激活炎症通路相关因子的表达。敲除Marchf2可以增加小鼠对细菌和病毒感染的抵抗性，并能增强先天免疫应答。这个基因在病毒的感染中发挥着重要的作用，是不是在新冠药物的开发中，也可以作为一个靶点呢？