一文了解CD40基因敲除小鼠【每周一鼠】

CD40基因

该基因是TNF受体超家族的成员，其编码的蛋白质是免疫系统抗原呈递细胞上的受体，对于介导多种免疫和炎症反应至关重要，包括T细胞依赖性免疫球蛋白类别转换、记忆B细胞发育和生发中心形成。该基因的突变可导致免疫缺陷，其相关通路有T辅助细胞中的ICos-ICosL通路和B细胞受体信号通路。

图1. CD40蛋白结构。

与CD40相关的疾病包括Hyper-Igm3型免疫缺陷和Hyper-Igm 1型免疫缺陷，脑脊髓炎的发生与免疫相关。该病常发生于非特异性病毒感染或疫苗接种后，也可见于服用某些药物或食物后（左旋咪唑、驱虫净、炸蝉蛹等）。该病的临床症状为高热、头疼、昏迷、意识模糊及烦躁不安等。此病治疗药物有降胆固醇药物（他汀类药物）、皮质类固醇激素及对症治疗的抗生素药物等^[1]。此外，研究人员也发现CD40的缺失会导致小鼠代谢功能障碍，代谢障碍可引发多种疾病，如高尿酸、高血压、高血糖、高血脂等，高血糖需降糖药物治疗，高血脂需服用降脂药物，高血压需口服降压药物^[2,3]。

CD40基因敲除小鼠

Aarts SA等人通过在CD40基因2~3号外显子之间插入loxP-Neo-loxP元件破坏CD40基因，通过与LysM^cre小鼠杂交产生骨髓特异性CD40敲除小鼠^[4]。

研究发现，CD40^fl/fl LysM^cre小鼠巨噬细胞中CD40表达量较WT小鼠降低84~89%。诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）后，CD40^fl/fl LysM^cre的临床评分（ 0=无神经异常；0.5=尾音部分丧失；1=完全丧失尾张力；2=后肢麻痹；3=部分后肢麻痹；4=完全后肢瘫痪；4.5=膈肌麻痹；5=死亡）低于CD40^fl/fl（WT）小鼠；与CD40^fl/fl小鼠相比，CD40^fl/fl LysM^cre的存活率更高（表1），体重减轻情况明显较轻；

CD40^fl/fl LysM^cre小鼠的中枢神经系统的CD45⁺白细胞浸润较CD40^fl/fl显著减少（图2）。结果表明，外周巨噬细胞CD40信号传导的丧失可改善EAE并预防炎症。

图2. 骨髓CD40缺乏小鼠表型^[4]。

来自CD40^fl/fl LysM^cre小鼠和CD40^fl/fl (WT) 小鼠的BMDM用FGK45(30µg/ml)和髓磷脂(40µg/ml)或IFN-γ(5ng/ml)和LPS(100ng)刺激6小时/毫升）。(A) 流式细胞仪测量的CD40的MFI。(B)CD40(40 kDa 条带大小)和α-微管蛋白(50kDa 条带大小)的蛋白质印迹和CD40^fl/fl LysM^cre 小鼠和CD40^fl/fl(WT) BMDMs中CD40蛋白表达的量化用FGK45刺激10分钟或24 H。(C) CD40^fl/fl LysM^cre小鼠和CD40^fl/fl的临床 EAE 评分(WT) 诱导后 20天的小鼠 ( n=12/组)。(D) 与第0天的起始体重相比体重变化百分比。(E)脊髓和小脑切片CD45、MAC3和CD3免疫染色的代表性图像。CD45：箭头、脊髓和小脑，500µm。MAC3和CD3：条形，脊髓，100µm；小脑，200µm。(F) CD45 (白细胞)、mac-3 (巨噬细胞) 和CD3(T 细胞) 免疫细胞浸润脊髓和小脑的计数。平均值±SEM。(A) 和 (B) 中的体外结果是三次独立实验的平均值±SEM，并且代表至少三个独立实验。*p<0.05与WT。

Aarts S等人的研究表明，CD40的缺失会导致小鼠代谢功能障碍^[3]。标准（SFD）和高脂（HFD）饲喂CD40^fl/flCD11c^cre和CD40^fl/fl（WT）小鼠18周发现，SFD饲喂组，CD40^fl/flCD11c^cre和CD40^fl/fl（WT）体重变化无显著差异性；HFD饲喂第12周后，CD40^fl/flCD11c^cre小鼠体重较CD40^fl/fl体重显著升高。标准（SFD）和高脂（HFD）饲喂18周，附睾脂肪组织重量在CD40^fl/flCD11c^cre和CD40^fl/fl之间无显著差异。与CD40^fl/fl相比，CD40^fl/flCD11c^cre小鼠的脂肪细胞大小增加了20.9%。HFD饲喂组，CD40^fl/flCD11c^cre小鼠血浆总胆固醇水平显著高于CD40^fl/fl小鼠，其血浆瘦素含量高于CD40^fl/fl小鼠（图 3）。此外，HFD饲喂18周后，CD40^fl/flCD11c^cre小鼠的肝脏重量、总胆固醇水平显著高于CD40^fl/fl小鼠，其脂肪变形等级与血浆ALT水平也显著高于CD40^fl/fl小鼠（图 4）^[3]。

图3. CD40^fl/flCD11c^cre小鼠的表型^[3]。

HFD上的CD40 ^fl/fl CD11c ^cre小鼠比 WT 小鼠更肥胖。( A ) 标准 (SFD) 或高脂饮食 (HFD) 喂养18周期间的体重增加。( B ) 喂食18周后附睾脂肪组织(EpAT)组织重量。( C )喂食18周后EpAT脂肪细胞大小和CD40^fl/flCD11c^cre小鼠和喂食HFD的WT小鼠EpAT的代表性HE图片（比例尺为100 µm）。（D）总血浆胆固醇和脂质部分。( E ) 血浆甘油三酯。( F) 血浆瘦素和脂联素水平。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05；**P <0.01 用于比较喂食相同饮食的WT 和 CD40 ^fl/fl CD11c ^cre小鼠。对于SFD，n=7/组，对于HFD，n=8/组。

图4. CD40^fl/flCD11c^cre小鼠的表型^[3]。

HFD18周后，CD40 ^fl/fl CD11c ^cre小鼠肝脏脂肪变性增加。( A ) 肝脏重量（克）。( B )肝脏总胆固醇/克蛋白和TG/克蛋白。( C ) 肝脏脂肪变性的组织病理学评分和肝脏的代表性H&E染色。( D ) 肝油红-O (ORO)染色和代表性图片的量化。( E ) 血浆肝酶：丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平、白蛋白水平和谷氨酸脱氢酶(GDH)活性。数据表示为平均值±SEM。*P<0.05, **P<0.01, ***p<0.001用于比较WT和CD40^fl/flCD11c^cre小鼠喂食相同的饮食。对于SFD，n=7/组，对于HFD，n=8/组。

小结

小鼠CD40功能丧失相关的免疫缺陷具有潜在的临床意义，因为它可能与脑脊髓炎、代谢障碍的病因有关，该基因突变可用于此类疾病发病机制的深入探讨，亦可用于此类疾病创新药物的研发。

参考文献：

1.Vigne S, Duc D, Peter B, Rebeaud J, Yersin Y, Ruiz F, Bressoud V, Collet TH, Pot C. Lowering blood cholesterol does not affect neuroinflammation in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 2022 Feb 7;19(1):42. doi: 10.1186/s12974-022-02409-x. PMID: 35130916.

2.Kang YE, Kim JM, Joung KH, Lee JH, You BR, Choi MJ, Ryu MJ, Ko YB, Lee MA, Lee J, Ku BJ, Shong M, Lee KH, Kim HJ. The Roles of Adipokines, Proinflammatory Cytokines, and Adipose Tissue Macrophages in Obesity-Associated Insulin Resistance in Modest Obesity and Early Metabolic Dysfunction. PLoS One. 2016 Apr 21;11(4):e0154003. doi: 10.1371/journal.pone.0154003. PMID: 27101398; PMCID: PMC4839620.

3.Aarts S, Reiche M, den Toom M, Gijbels M, Beckers L, Gerdes N, Lutgens E. Depletion of CD40 on CD11c+ cells worsens the metabolic syndrome and ameliorates hepatic inflammation during NASH. Sci Rep. 2019 Oct 11;9(1):14702. doi: 10.1038/s41598-019-50976-6. PMID: 31604965; PMCID: PMC6789104.

4.Aarts SA, Seijkens TT, Kusters PJ, van Tiel CM, Reiche ME, den Toom M, Beckers L, van Roomen CP, de Winther MP, Kooij G, Lutgens E. Macrophage CD40 signaling drives experimental autoimmune encephalomyelitis. J Pathol. 2019 Apr;247(4):471-480. doi: 10.1002/path.5205. Epub 2019 Jan 30. PMID: 30471110; PMCID: PMC6519352.