肿瘤免疫研究？来看看这个单细胞测序！

尽管开发单细胞测序方法取得了巨大进展，但仍然存在很大的局限性。在 DNA 方面，由于与全基因组扩增（whole-genome amplification, WGA）相关的问题，例如等位基因丢失（即随机、优先扩增和测序二倍体单细胞基因组中任何特定基因的两个等位基因之一）、基因组覆盖率低以及缺乏能够进行 DNA 分子计数的方法（这将极大地有助于识别等位基因丢失，特别是在多倍体癌症基因组中） 。此外，核酸固有的化学不稳定性（例如，胞嘧啶碱基的脱氨基作用）和与用于扩增单细胞 DNA 的聚合酶相关的内在错误率进一步增加了测序的复杂性。

在 RNA 方面，因为数据稀疏、采样偏差、低水平转录本基因表达的丢失，很难将观察到的单细胞数据变异归因于技术偏差还是生物学变异。这些问题很大程度上源于单细胞转录组方法中 mRNA 捕获的相对低效率，其捕获效率在 5% 到 15% 之间。^[2]

单细胞测序可用于研究癌症发展各个阶段的遗传学和生物学。例如起源细胞（具备产生癌症能力的细胞亚群）、癌前病变、原位癌、癌症转移等研究等。肿瘤组织内的细胞具有不同的遗传和表型特征，通过检测肿瘤细胞的异质性，绘制肿瘤细胞和肿瘤微环境的细胞图谱。进一步明确肿瘤组织内的细胞群，寻找特异性标志物，解释肿瘤发生、转移等一系列问题。

Figure 3 苏木精和伊红 (H&E) 染色和结直肠腺癌发展不同阶段的示意图，以及单细胞测序在各个阶段的应用。^[1]

CAR-T细胞疗法在血液瘤的治疗已经取得了长足的进展，目前已有8款CAR-T产品上市，其中6款针对CD19抗原，2款针对BCMA抗原。然而。CAR-T治疗会引起神经毒性在内的多种不良反应。神经毒性发生的机制尚不清楚。来自斯坦福大学的Kevin R. Parker和 Denis Migliorini等人利用单细胞测序发现了人脑壁细胞中表达CD19抗原，并推测CAR-T细胞对壁细胞的“On-target, off-tumor”攻击可能是造成神经毒性的潜在原因。^[3]

该项研究首先分析了scRNA-Seq数据集，鉴定人体中CD19阳性细胞，发现了CD19在人脑壁细胞中高度表达。

Figure 4 CD19在脑周细胞特异性表达。^[3]

随后，该研究组在小鼠模型中进行了神经毒性分析。在C57BL/6J小鼠的脑组织中发现了CD19阳性细胞。为了避免B细胞表达CD19抗原对实验结果的影响，该研究组进一步使用了重度免疫缺陷小鼠（NSG小鼠，无B细胞）进行了分析实验，并构建CAR-T细胞验证神经毒性。结果发现，靶向鼠源CD19的CAR-T细胞造成了血脑屏障通透性的增加，而靶向人CD19的CAR-T细胞则没有此类影响。

通过对比小鼠脑周细胞和人脑周细胞的单细胞测序结果，发现小鼠脑周细胞中CD19的表达量低于人脑，而且小鼠细胞类型和转录状态的物种特异性差异可能与人类特异性病理生理学不完全匹配。据报道，最初在小鼠模型中进行的 CAR-T 细胞研究并未预测到后来在人体临床试验中观察到的神经毒性程度。^[4]

因此，Kevin R. Parker和 Denis Migliorini等人利用scRNA-seq 技术分析相关抗原的表达对CAR-T细胞的研究是极其重要的。scRNA-seq可以捕获稀有的细胞群，其检测指标在靶向治疗的临床效果中可能至关重要，而在未来CAR-T细胞的功能越来越强，可能会识别多个靶点抗原的组合，也会越来越多地应用于实体瘤的研究。实体瘤与正常组织共享大多数抗原，因此单细胞测序可用于发现和设计高效特异性的靶点，成为研究免疫疗法的有力工具。