困局？破局？——UCAR-T细胞疗法如何杀出重围

一、CAR-T细胞面临的挑战

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)-T细胞技术，指将特异性识别肿瘤细胞抗原的CAR分子表达在患者的T细胞上，使T细胞在CAR分子引导下迁移至肿瘤部位，产生杀伤效应。截止到今年，全球已经有7款CAR-T细胞治疗产品上市，其中在中国也有三款CAR-T细胞治疗产品先后上市，均取得较好的疗效。可以看出，CAR-T细胞技术在肿瘤治疗上有很大的应用潜力。由于该疗法以患者自体T细胞为基础进行修饰，因此在应用上会面临以下的挑战。

▶ 患者T细胞的质量和数量不满足制备的要求

患者体内存在肿瘤微环境，肿瘤抑制信号会大大降低患者自体T细胞的增殖活性。且由于患者体内细胞因子的缺乏也会降低T细胞的活化，最终导致T细胞的数量减少、活性降低和功能障碍。此外，患者在接受治疗的过程中，会反复进行放疗和化疗，免疫能力低下，导致T细胞数量和功能均降低。

▶ 价格昂贵与制备时间过长

自体CAR-T疗法是一种个性化定制的治疗方式，经历自体T细胞的采集分选、CAR分子转导T细胞、CAR-T细胞扩增、产品质检等多个环节，每个环节删除的耗时久且成本高昂，因此患者很可能错过宝贵的治疗时间，并且承担沉重的经济负担。

二、UCAR-T细胞的构建原理

基于自体型CAR-T疗法所面临的局限和挑战,通用型CAR-T(universal CAR-T,UCAR-T)疗法开始受到关注。UCAR-T细胞是指提前采集健康的异体T细胞，通过基因工程技术对该异体T细胞进行改造，最终制备而成的CAR-T细胞。UCAR-T细胞没有免疫排斥反应，利用这种细胞不仅能为多名患者提供现货型的药物疗法，还可产业化生产，节省成本并缩短治疗时间。

使用UCAR-T细胞疗法杀伤肿瘤，其中的技术难点是需要克服移植物抗宿主病（graft-versus-host disease, GvHD）和宿主抗移植物反应(host versus graft reaction, HvGR)等免疫排斥的问题，同时提高UCAR-T细胞的活性。

▶ GvHD现象

异体CAR-T细胞进入患者体内，会引起杀伤患者正常细胞的GvHD现象。由于异体CAR-T细胞表面存在正常的TCR受体，能特异识别APC或靶细胞提呈的抗原肽-MHC分子复合物，以此识别患者体内的正常细胞并进行杀伤，产生毒害作用。因此，要避免GvHD现象，就需要破坏UCAR-T细胞表面的TCR受体。TCR受体由α链和β链（在αβT细胞中）或γ链和δ链（在γδT细胞中）组成。其中α链和β链组合的TCR受体具有MHC限制性，因此只需破坏α链（TCR alpha constant，TRAC）或β链（TCRbeta constant，TRBC）即可达到目的。考虑到β链基因包含2个恒定区，而编码α链的基因只有1个。因此，敲除TRAC是避免GvHD最为简便且有效的方法。

▶ HvGR反应

UCAR-T细胞对于患者来说是一种“外来”细胞，患者体内的免疫系统会特异识别UCAR-T细胞并进行清除，这便是HvGR反应。UCAR-T细胞在体内的存活时间与疗效密切相关，因此HvGR是UCAR-T细胞疗法面临的第二个挑战。产生HvGR的一个重要原因是细胞表面存在HLA分子。HLA分子能作为抗原提呈分子参与适应性免疫应答，因此UCAR-T细胞表面的HLA分子可被患者体内的T细胞识别并被清除。避免HvGR需要破坏UCAR-T细胞表面的HLA分子。HLA分子主要是HLA-I类分子，由3条α链和1个β2微球蛋白组成。因此，敲除β2微球蛋白则可以降低HvGR反应。

此外，研究发现针对UCAR-T细胞表面，敲除或者过表达某些分子可提高UCAR-T细胞的活性和疗效，比如PD-1、CTLA-4、CD94/NKG2A、TIM-3、LAG-3等信号分子。PD-1（programmed death 1）是重要的共抑制分子，表达在活化的T细胞上。PD-1与配体结合后可抑制T细胞的增殖。CTLA-4也是一种共抑制分子，能与CD80和CD86配体结合并下调或终止T细胞活化。因此，敲除PD-1和CTLA-4可提高UCAR-T细胞的活性。CD94/NKG2A是NK细胞抑制性受体，在UCAR-T细胞引入CD94/NKG2A可降低患者NK细胞对UCAR-T细胞的杀伤。

三、CRISPR/Cas系统在UCAR-T细胞的应用

为了实现对上述基因的编辑，使用CRISPR/Cas系统是一种有效的方式。已经有相当多的研究使用CRISPR/Cas系统敲除异体T细胞中的TCR、HLA和PD-1等分子并制备成UCAR-T细胞，可有效地避免GvHD和HvGR等免疫排斥反应且取得很好的疗效。比如在以下的一篇报道中，研究人员使用CRISPR/Cas系统创建了TCR^-/-和HLA^-/-的双敲除T细胞（gRNAs被设计用于靶向TCR α恒定区外显子1内的序列，TCR β恒定区1和2的外显子1共有的共有序列，β-2微球蛋白的外显子1）。经检测，GvHD的效应大大降低（图1）。

图1 敲除TCR和B2M可有效降低GvHD的效应^[1]

之后该研究将CD19-CAR慢病毒转导至T细胞，并筛选出TCR-/-、HLA-I-/-且CD19-CART阳性的细胞。经过检测，该UCAR-T细胞具有强大的体外抗肿瘤活性（图2）。

图2 TCR^-/-和HLA-I^-/-的CD19-CAR-T具有高效的抗肿瘤效应^[1]

四、总结

在异体T细胞中敲除TCR受体和HLA分子避免GvHD和HvGR等免疫排斥反应，再通过编辑部分基因提高T细胞的稳定性和疗效，并以此为基础制备成CAR-T细胞，这是UCAR-T细胞的构建思路。随着抗肿瘤机制研究的深入，必将发现更多可提高UCAR-T细胞疗效的分子，再通过CRISPR/Cas技术对这些基因进行编辑，可以创建出高效且适应不同病患的UCAR-T细胞，为患者带来治愈的希望。