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杜氏肌营养不良(DMD)致病基因是什么?临床特征有哪些?
疾病概述
对于父母来说见证宝宝一点点学会走路，从独立行走再到学会奔跑，是多么难忘的时刻！但对于患了杜氏肌营养不良罕见病的宝宝来说，他们不能用自己的双腿走路、奔跑；对于普通人再平常不过的行动，对他们却成了一种可望而不可及的梦想。
杜氏肌营养不良（duchenne muscular dystrophy, DMD）是一种X连锁隐性遗传的肌肉变性疾病，活产男婴发病率为1/3500，女性多为致病基因携带者，发病者罕见，且症状较轻。在男患中症状较重，DMD发病年龄偏小，起病隐蔽，病程长，2-5岁患者全身骨骼肌进行性无力、萎缩和小腿腓肠肌假性肥大，走路呈现鸭步态、易摔跤、上下楼梯难，10岁左右因肌无力症状渐进性发展而不能行走，20岁左右会患心力衰竭或坠积性肺炎等消耗性疾病。目前该病发病机制尚未阐明且暂无有效治疗方法。现有治疗只能减缓DMD患者肌肉萎缩进程，延长3-5年行走能力，增强心肺功能[1-2]。
图1 DMD患者小腿腓肠肌假性肥大
Dys基因结构、表达以及功能
Dys基因结构：DMD由抗肌萎缩蛋白（Dystrophin, Dys）基因突变所致，属于进行性肌营养不良症常见类型。已证实人类Dys基因定位于X染色体短臂上（Xp21.1-3），基因全长约2220kb，含79个外显子，cDNA长14kb，是目前已知的最大人类基因。
全长型抗肌萎缩蛋白存在于骨骼肌的肌膜下，由3685个氨基酸组成，相对分子质量为427KDa。共分为4个区域，如图2B中的全长所示：（1）氨基端区域：与a-辅肌动蛋白（a-actinin）同源，包含第14-240氨基酸，跨越1-8号外显子，与细胞内的丝状肌动蛋白（F-actin）相连接；（2）中央棒状区：包含第253-3040氨基酸，跨越9-63号外显子，由24个三聚螺旋状重复结构（repeat, R）组成，每个重复结构由109个氨基酸组成，与a-肌动蛋白（a-actin）和血影蛋白（spectrin）同源。重复结构被4个富含脯氨酸的铰链（hinge, H）结构分隔开，在4个铰链结构处转折形成三股螺旋状结构；（3）富含半胱氨酸区域：第3080-3360氨基酸，跨越64-68号外显子，与位于肌膜上的糖蛋白复合体相连，此区是与肌膜结合所必需的结构；（4）羧基端区域：第3361-3685氨基酸，跨越68-79号外显子，含有许多磷酸化位点，与细胞内的syntrophins蛋白相连。
Dys基因表达具有组织特异性。该基因由7个独立的启动子控制在不同组织中表达（图2A）。其中有3个启动子分别控制在大脑、肌肉和小脑浦肯野纤维中的表达，表达亚型为基因全长。3个全长亚型包括唯一的一个从1-79号外显子的连接；另外4个内部启动子，启动较短形式的抗肌萎缩蛋白基因的转录，以DMD基因第30、45、56、和63号外显子作为第一个外显子启动转录，产物分别为Dp260（Mr=260000）、Dpl40（Mr=140000）、Dpl16（Mr=116000）和Dp71（Mr=71000）。
图2 抗肌萎缩蛋白基因及表达[3]
A.位于Xp21，黑色的竖线代表分布于整个基因上的79个外显子，黑色箭头指示各组织特异性启动子不同的启动位点，分别以不同的字母缩写来代表：B（脑皮质）、M（肌组织）、P（蒲肯野纤维）、R（视网膜）、B3（脑组织）、S（雪旺细胞）和G（肌组织之外的多种组织器官）。
B.不同形式的抗肌萎缩蛋白及其区域组成：氨基端区域、中央棒状区域、富含半胱氨酸区域及羧基端区域。
Dys的功能：Dys的羧基端和富含半胱氨酸的区域在整个框架蛋白中发挥作用，如图3所示：Dys和抗肌萎缩蛋白聚糖（dystroglycans）、sarcoglycan、syncoilin、syntrophin和dystrobrevin等蛋白装配在一起形成抗肌萎缩蛋白的结合蛋白复合物（dystrophin-associated protein complex, DAPC）。DAPC形成了一个穿过肌膜传递信号，连接细胞外基质和细胞内肌动蛋白骨架的重要结构。Dys基因表达的缺乏会影响DAPC的形成，使分子桥中断，至少导致两个结果：第一，细胞膜变得更脆弱，在肌肉离心性收缩的时候会被机械力破坏；第二，框架蛋白，尤其是对机械力敏感的离子通道将会失调[3]。
图3 抗肌萎缩蛋白及相关蛋白在肌细胞膜上的功能[3]
抗肌萎缩蛋白的多样性蛋白在细胞膜上形成了一种稳定连接细胞外基质和细胞内骨架的连接结构
临床特征
根据DMD症状出现的时序性特点，有学者将DMD临床经过分为5个阶段：
第一阶段（隐匿期）：偶然发现CK升高或有家族史，可能在本阶段会被诊断，此阶段出现发育迟缓，没有步态异常。
第二阶段（可步行早期）：Gowers征、走路摇摆，走路时足尖着地，可爬楼梯。
第三阶段（可步行晚期）：走路日渐困难，丧失爬楼梯和仰卧起立的能力。
第四阶段（不能步行早期）：短时间自行移动、能保持坐姿，出现脊柱侧弯。
第五阶段（不能步行晚期）：上肢功能和姿势维持逐渐受限｡
女性多为无症状携带者，但约10%的女性携带者可有轻度的临床表现，极少数出现类似于男性患者的严重症状，原因可能与Xp21.2缺失、X染色体非选择性失活、X染色体复杂重排或单亲二倍体等原因有关[4]。部分女性成年期出现DMD相关性扩张性心肌病，其特点为左心室扩张和充血性心力衰竭[5]。
图4 杜氏肌营养不良患者呈进行性肌营养不良
临床检测
DMD相关临床检测：
实验室检查
DMD血清检测发现血清肌酸磷酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、谷氨酸草酰乙酸转氨酶（GOT）等均增高，尤其是CK显著增高，可达正常者的50倍。DMD血清学检测值增高多发生在早期和进展期，在晚期不明显，CK值增高是本病的特征性临床表现，在患儿出现明显的临床症状前，已有显著增加，特异性很高[3]。
肌电图
通常提示肌源性损害｡
肌肉活检
早期表现非特征性，晚期出现肌细胞萎缩,脂肪、结缔组织增生，免疫组化或免疫印迹提示抗肌萎缩蛋白明显减少或消失。
超声心动图
扩张型心肌病改变｡
呼吸功能
提示呼吸肌无力,呼吸功能降低[5]。
诊断进展
DMD新生儿筛查已在英国、德国、美国等国家进，其方法为以CK作为检测指标,阳性召回病例经DMD基因检测确诊，使DMD诊断进一步提前。浙江省筛查中心2016-2017年共筛查42862例浙江省出生男性新生儿,基因确诊11例，发病率1：3896。DMD筛查不仅使患者得到早期诊断、早期治疗，同时为有先证者家庭的下一胎产前诊断提供帮助，真正做到减少DMD缺陷患儿的出生。这可以通过绒毛膜取样或羊膜腔穿刺技术完成。DMD筛查目前仍存在较高的假阳性率及假阴性率，有待进一步研究改进[5]。
以往DMD诊断通常在患儿出现运动功能减退，腓肠肌肥大后，通过肌酸激酶、肌电图及肌活检证实。近年随着基因检测技术的快速进展及数据库的积累，基因检测已成为目前诊断DMD的主要手段｡DMD基因定位于Xp21，是至今为止已知的人类最大基因 （2500kb），包括79个外显子、78个内含子和8个启动子。突变形式多样，其中大片段缺失约占DMD65%；大片段重复约占DMD5%-10%；其余突变为微小突变，包括碱基的缺失、插入、置换、内含子突变、复杂的染色体重排等。DMD患儿的临床表现与患儿DMD的基因缺失之间的关系取决于基因突变是否对翻译阅读框架造成改变，即“阅读框架规则”。大多数破坏阅读框架的突变会导致Dstrophin蛋白质的丢失，使患者产生DMD表现。当DMD基因突变存在于阅读框内时，可产生一种截短的、仍有部分功能的肌营养不良蛋白，使患者表现为临床症状较为温和的贝氏肌营养不良（becker muscular dystrophy, BMD）[6]。也有少部分患者不符合阅读框的假设，而这些异常的原因尚不清楚。
近年随着DMD基因检测的快速进展，出现一些通过基因型预测表型的软件工具。有学者运用其开发的计算机软件“DMD toolkit”，利用相关系数，回归系数，谱系图，直方图，趋势线的散点图，茎叶图等统计学方法来可视化突变位点结构和预测抗肌萎缩蛋白突变位点功能改变，并通过统计学方法预测DMD临床表型[5]。广州罕见病基因治疗联盟的牵头单位清华珠三角研究院联合赛业生物开发了罕见病数据中心（RDDC）网站：https://rddc.tsinghua-gd.org/，RDDC对不同来源的同一基因信息进行了深度整合，以高度简洁性和交互性提高研发者信息获取效率，提供AI突变剪接预测、AI突变致病性预测等不同的工具为科研学者来带便利，这些进展大大减少了有创性肌肉活检，也使肌损伤前诊断成为可能｡
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