B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠

产品编号：C001538

品系全称：C57BL/6NCya-Col7a1^{em2(hCOL7A1*c.6527dupC)}/Cya

品系背景：C57BL/6NCya

传代建议：杂合与野生型人源化小鼠互配（若需纯合子开展实验，建议杂合与杂合互配）

品系描述

大疱性表皮松解症（EB）是一种皮肤黏膜受轻微外伤或摩擦后形成水疱和大疱的遗传性皮肤病，常见的临床症状为皮肤出现水疱、血疱和糜烂等。根据发病部位的不同可将遗传性EB分为三类：单纯性大疱性表皮松解症（EBS）、交界性大疱性表皮松解症（JEB）和营养不良性大疱性表皮松解症（DEB）。COL7A1基因的突变是营养不良性大疱性表皮松解症（DEB）的病因，DEB所呈现的不同临床表型与COL7A1基因的突变位点和形式相关。COL7A1基因编码Ⅶ型胶原蛋白，该蛋白形成的锚定纤维将真皮层组织结合到表皮层组织上，COL7A1突变导致的功能性锚定纤维缺乏会造成患者皮肤极其脆弱，容易因轻微的摩擦或创伤而引起水疱或撕裂。目前至少已经发现324个与DEB相关的COL7A1基因致病突变，包括无义、错义、缺失、插入、剪接和调控等多种突变类型 ^[1]。

目前在研的DEB治疗管线以基因疗法和小核酸药物为主，包括ASO药物、siRNA药物以及基于CRISPR和AAV载体递送的基因疗法等，在其中，COL7A1是最为重要的治疗靶点。Krystal Biotech公司研发的B-Vec通过HSV-1载体将功能性COL7A1基因递送到COL7A1突变导致的DEB患者皮肤细胞中，产生功能性蛋白以促进伤口愈合，是该疾病首个获批上市的基因治疗药物。此外，由于大多数ASO、siRNA和基于CRISPR的疗法均作用于人源COL7A1基因，考虑到动物和人在基因上的差异性，将小鼠基因进行人源化修饰将有助于推动靶向COL7A1的疗法进一步向临床转化。本品系通过在小鼠Col7a1人源化模型（产品编号：C001428）基础上引入COL7A1基因在人类疾病中常见复发性突变（c.6527dupC）所构建的疾病模型 ^[2]，该品系纯合子会出现与人类营养不良性大疱性表皮松解症（DEB）相似的疾病表型，并在出生后10天内死亡。此外，基于自主研发的TurboKnockout融合BAC重组的技术创新，赛业生物可针对不同点突变提供定制服务，以满足广大研发人员关于大疱性表皮松解症疾病的药效学等实验需求。

构建方式

通过基因编辑技术将c.6527dupC突变引入到B6-hCOL7A1小鼠（产品编号：C001428）中已存在的人源COL7A1基因的第81号外显子中。

研究应用

B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠可用于营养不良性大疱性表皮松解症（DEB）机制研究，以及治疗药物的研发、筛选和评价。

验证数据

• 纯合B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠成功表达人源COL7A1基因

图1. 纯合B6-hCOL7A1小鼠、杂合B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠、纯合B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠和野生型小鼠（WT）体内人源COL7A1基因和鼠源Col7a1基因表达的RT-qPCR检测。检测结果显示，纯合B6-hCOL7A1小鼠和B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠均不表达鼠源Col7a1基因，但能表达与之相等水平的人源COL7A1基因（注：c.6527dupC突变不影响基因转录，但会导致蛋白表达异常，因此在mRNA水平不存在表达差异）。

ND：Not detected，未检测到。

• 纯合B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠缺少COL7A1蛋白的表达

图2. 纯合B6-hCOL7A1野生型人源化小鼠（HO）、杂合B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠（HE）和纯合B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠（HO）体内COL7A1蛋白表达的免疫组化检测。数据显示，B6-hCOL7A1小鼠和杂合B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠均表达COL7A1蛋白，而纯合B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠则不表达COL7A1蛋白。此外，纯合B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠的皮肤组织还出现了表皮和真皮层分离。

• 纯合B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠出现明显皮下水肿

图3. 野生型小鼠（WT）和纯合B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠（HO）皮肤组织H&E染色检测。数据显示，与野生型小鼠相比，纯合B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠的皮肤出现显著的皮下水肿，并观察到表皮和真皮层分离现象（绿色星号所示）。

• 纯合B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠表现出皮肤红肿起泡表型

图4. 野生型小鼠（WT）和纯合B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠（HO）的外观监测。数据显示，与野生型小鼠相比，纯合B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠在出生第一天出现前/后爪红肿水泡，第二天前后掌以及尾巴都有红肿水泡的现象；第七天时未见红肿水泡样，但出现大面积脱皮现象。此外，纯合B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠的体型明显小于野生型小鼠，最终小鼠会在出生后10天内死亡。

表型总结

B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠成功表达人源COL7A1基因且不表达鼠源Col7a1基因。由于c.6527dupC突变的存在，虽然在mRNA水平上人源COL7A1基因的表达正常，但蛋白水平的表达却被阻断，导致COL7A1蛋白的缺失。COL7A1蛋白缺失引发了一系列的表型变化，包括皮肤组织中表皮和真皮层的分离，皮下水肿，以及皮肤红肿和起泡。此外，这些小鼠的体型明显小于野生型小鼠，并且在出生后的10天内会死亡。此外，赛业生物还可提供Col7a1 KO小鼠模型，该模型疾病表型较本品系更加严重，且纯合Col7a1 KO小鼠在出生后3天就会死亡。

罕见病数据中心（RDDC）

• 基因基本信息

• 临床突变信息

• 疾病介绍

大疱性表皮松解症（Epidermolysis bullosa, EB）是一种皮肤黏膜受轻微外伤或摩擦后形成水疱和大疱的遗传性皮肤病，常见的临床症状为皮肤出现水疱、血疱和糜烂等。依据发病部位的不同可将遗传性EB分为三类：单纯性大疱性表皮松解症（simplex EB, EBS）、交界性大疱性表皮松解症（junctional EB，JEB）、营养不良性大疱性表皮松解症（dystrophic EB, DEB）。其中，COL7A1基因是营养不良性大疱性表皮松解症（DEB）的相关致病基因，DEB所呈现的不同临床表型与COL7A1等位基因突变的位点和形式的不同相关。目前，至少已经发现324个与DEB相关的COL7A1基因致病突变，包括43个无义突变、127个错义突变、65个缺失突变、28个插入突变、9个插入/缺失突变、51个剪接位点突变和1个调控突变。

• 基因及突变介绍

COL7A1基因编码Ⅶ型胶原蛋白，该蛋白形成的锚定纤维将真皮层组织结合到表皮层组织上。功能性锚定纤维的缺乏将会导致皮肤极其脆弱，容易因轻微的摩擦或创伤而引起水疱或撕裂。

引发DEB的COL7A1基因存在部分热门突变位点，73号外显子即为其中之一。在西班牙，DEB患者的80号外显子中含有高度流行的移码突变。c.6527insC（c.6527dupC）是高度流行的纯合子突变，该插入突变导致过早终止密码子，占西班牙隐性DEB患者人群中等位基因的46%。大多数隐性DEB患者在每个染色体上都有两个不同的复合杂合突变 ^[2-3]。

• 非编码区功能

COL7A1基因内含子突变会导致疾病发生。内源性5′反式剪接修复可纠正COL7A1基因内致病突变 ^[4]。

• 基因治疗

靶向COL7A1的药物以基因治疗药物为主，包括ASO、siRNA、CRISPR、AAV递送等。其基因治疗药物的管线数量多且类型丰富，比如，Krystal Biotech公司的B-Vec是一种非创伤性的基因治疗药物，通过凝胶涂抹的形式，利用HSV-1递送COL7A1基因，为患者提供两个正常功能的COL7A1基因拷贝 ^[5]。又如，ProQR公司的管线QR-313是一种基于COL7A1基因73号外显子跳跃的ASO药物 ^[6]。此外，已有报道使用CRISPR方式来修复COL7A1基因的突变，该研究针对c.6527dupC突变的修复，使用皮肤人源化小鼠模型进行药效探究 ^[7]。

综上所述，COL7A1基因是大疱性表皮松解症的重要致病基因。该疾病的治疗方式以基因治疗为主，并使用人源化小鼠开展药物临床前实验。B6-hCOL7A1*c.6527dupC小鼠可以应用于大疱性表皮松解症基因治疗的临床前研究，并可针对不同点突变还可提供模型定制服务。

参考文献

[1]Dang N and Murrell DF. Mutation Analysis and Characterization of COL7A1 Mutations in Dystrophic Epidermolysis Bullosa. Exp Dermatol 2008;17(7) 553-568.

[2]García M, Bonafont J, Martínez-Palacios J,et al. Preclinical model for phenotypic correction of dystrophic epidermolysis bullosa by in vivo CRISPR-Cas9 delivery using adenoviral vectors.[J].Mol Ther Methods Clin Dev. 2022

[3]Turczynski,Sandrina,Tonasso,et al.Targeted Exon Skipping Restores Type VII Collagen Expression and Anchoring Fibril Formation in an In Vivo RDEB Model[J].The Journal of investigative dermatology, 2016.

[4]Mayr E, Ablinger M, Lettner T,et al. 5'RNA Trans-Splicing Repair of COL7A1 Mutant Transcripts in Epidermolysis Bullosa[J].Int J Mol Sci. 2022

[5]In vivo topical gene therapy for recessive dystrophic epidermolysis bullosa: a phase 1 and 2 trial[J].Nature Medicine[2023-07-13].DOI:10.1038/s41591-022-01737-y.

[6]Bornert O , Hogervorst M , Nauroy P ,et al.QR-313, an antisense oligonucleotide, shows therapeutic efficacy for treatment of dominant and recessive dystrophic epidermolysis bullosa: a preclinical study[J].Journal of Investigative Dermatology, 2020.DOI:10.1016/j.jid.2020.08.018.

[7]Hainzl S , Peking P , Kocher T ,et al.COL7A1 Editing via CRISPR/Cas9 in Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa.[J].Molecular Therapy the Journal of the American Society of Gene Therapy, 2017, 25(11).DOI:10.1016/j.ymthe.2017.07.005.